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宮頸炎癥又稱宮頸糜爛，是常見婦科宮頸病變疾病之一，是慢性宮頸炎發(fā)病進(jìn)程中常見的局部病理性改變。宮頸管黏膜上皮由單層柱狀上皮構(gòu)成，抗病毒感染能力差，易受條件致病菌影響。相關(guān)研究表明，人乳頭瘤病毒（HPV）長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)感染，尤其是HPV16、HPV18等黏膜高危致癌性的病毒，一定程度上增加了宮頸上皮的瘤變，也提高了宮頸癌的發(fā)生率，HPV16和HPV18與世界上70%～76%的宮頸癌相關(guān)。同時(shí)，加德納菌等條件致病菌所引起的黏液膿性宮頸炎會(huì)增加HPV的感染風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步提高了宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。椿乳凝膠的處方組成為：椿皮、苦參、牡丹皮、乳香、冰片5味藥，具有清熱燥濕、祛瘀生肌的功效，其功能主治為濕熱淤阻型慢性宮頸炎。臨床藥理學(xué)研究報(bào)道：該方具有抗炎、活血化瘀、收斂消腫的功效，能促進(jìn)正常鱗狀上皮細(xì)胞再生，消除病因，清除局部感染及壞死組織，促進(jìn)正常宮頸細(xì)胞的修復(fù)再生。因此，本文采用HPV陽(yáng)性的宮頸癌細(xì)胞CaSki和Hela，就椿乳凝膠清除各類黏膜高危型HPV和調(diào)節(jié)陰道菌群平衡，治療宮頸炎癥和預(yù)防宮頸癌的機(jī)制進(jìn)行如下研究。

1、材料

1.1  試藥

 椿乳凝膠（規(guī)格：4 g/支，批號(hào)：20180804，株洲千金藥業(yè)股份有限公司）。西多福韋CDV（批號(hào)：20171125，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所）。高糖DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)：AB10201637，HyClone公司）；胎牛血清（Sciencell公司，批號(hào)：M048-6）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：3211713）、CCK-8（批號(hào)：B34304）（Bimake公司）；HPV16 E6抗體/ HPV18 E6抗體（批號(hào)：GR247586-18）、HPV16 E7抗體（批號(hào)：GR264171-1）、HPV18 E7抗體（批號(hào)：GR241906-1）（Abcam公司）；HEPES（Sigma公司，批號(hào)：SLBQ1006V）；朊蛋白胨（BD公司，批號(hào)：6060563）；新鮮酵母提取物（GIBCO公司，批號(hào)：1819083）；馬血清（Solarbio公司，批號(hào)：912I051）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20150921）。

1.2  細(xì)胞及菌株

  人宮頸上皮細(xì)胞H8、人宮頸癌細(xì)胞CaSki（HPV 16陽(yáng)性）、人宮頸癌細(xì)胞Hela（HPV 18陽(yáng)性）（豪地華拓生物科技有限公司）。加德納菌（GV-10-1）和白假絲酵母菌（浙江欣力菲生物科技有限公司）

1.3 儀器 

3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；DMIL型倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；MR-96A型酶標(biāo)儀（深圳邁瑞公司）；CJ-1F型醫(yī)用凈化工作臺(tái)（蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司）；Accuri C6型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；PowerPacTM Basic型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；BSCIIB2-1101型生物安全柜（上海瑞仰凈化裝備有限公司）；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2、方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將人宮頸上皮細(xì)胞H8、人宮頸癌細(xì)胞CaSki、人宮頸癌細(xì)胞Hela復(fù)蘇后接種于5 mL DMEM完全培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后備用。

2.2  菌株培養(yǎng)

取凍存的加德納菌或白假絲酵母菌，水浴融化后接種至9 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基試管內(nèi)并混勻，同時(shí)制備一管不加菌液的培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照管，硅膠塞封口后，將試管置于合適條件下培養(yǎng)24～48 h，分別將加德納菌或白假絲酵母菌用相應(yīng)培養(yǎng)液配制成濃度為1×107 CFU·mL－1的菌液，備用。

2.3  CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的H8、CaSki、Hela細(xì)胞，分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置溶媒對(duì)照組、椿乳凝膠不同濃度組（最大溶解度10 mg·mL^－1為最大濃度，以接近√10為梯度差下設(shè)5個(gè)濃度：0.03、0.1、0.3、1、3 mg·mL^－1），同時(shí)設(shè)置西多福韋（3、10、30、100、300、1000 μg·mL^－1）作為陽(yáng)性對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔。采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞存活情況。

2.4  流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人宮頸上皮細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H8細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置溶媒對(duì)照組、椿乳凝膠組（低、中、高濃度），陽(yáng)性對(duì)照組，每組6個(gè)復(fù)孔。24 h后，常規(guī)消化收集細(xì)胞，用70%冷乙醇固定過夜，加5 μL的PI，室溫避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

2.5  CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CaSki和Hela細(xì)胞，以5×105個(gè)/孔的密度接種至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)置溶媒對(duì)照組、椿乳凝膠低、中、高濃度組，陽(yáng)性對(duì)照不同濃度組，每組6個(gè)復(fù)孔。24 h后，收集細(xì)胞，加入500 μL Binding Buffer緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL的Annexin V-FITC、5 μL的PI，在室溫避光條件下孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡情況。

2.6 HPV16 E6/E7蛋白、HPV18 E6/E7蛋白表達(dá)檢測(cè)

細(xì)胞處理方法同步驟“2.5”項(xiàng)下，處理24 h后分別提取各孔總蛋白，用Western Blot法檢測(cè)E6/E7蛋白表達(dá)。

2.7  最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

將椿乳凝膠配制為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 mg·mL^－1濃度的混懸液，將西多福韋配制成1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8 μg·mL^－1濃度的溶液，各組濃度藥液均放置在試管中。每管中藥液為1.8 mL，各管中加入1×107 CFU·mL^－1加德納菌或白假絲酵母菌懸液200 μL，用透氣硅膠塞塞好試管，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（菌液中加入培養(yǎng)基作為對(duì)照）、陽(yáng)性對(duì)照組（培養(yǎng)液中不加菌液）。將各管適宜條件下培養(yǎng)48 h，觀察無細(xì)菌生長(zhǎng)的濃度，即為最小抑菌濃度（MIC），在肉眼觀察后，將肉眼未見渾濁濃度的培養(yǎng)液搖晃均勻，取100 μL上層液體，均勻涂布至相應(yīng)平板上，進(jìn)行加德納菌或白假絲酵母菌的活菌計(jì)數(shù)。

2.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以x±s表示，兩樣本均數(shù)的比較采用Student T-Test檢驗(yàn)，多樣本組間均數(shù)的比較采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3、結(jié)果

3.1 椿乳凝膠對(duì)H8、CaSki和Hela細(xì)胞增殖的影響 

H8、CaSki和Hela細(xì)胞給予不同濃度的椿乳凝膠后，鏡下觀察，H8和CaSki細(xì)胞形態(tài)學(xué)未出現(xiàn)明顯變化，細(xì)胞增殖未受到明顯影響，細(xì)胞增殖抑制率均＜20%。在高濃度下，Hela細(xì)胞出現(xiàn)增殖速度減慢，細(xì)胞碎片增多、細(xì)胞間的間隙增大、部分細(xì)胞呈空泡狀等現(xiàn)象。且Hela細(xì)胞狀態(tài)與椿乳凝膠濃度有明確相關(guān)性，在10 mg·mL^－1濃度條件下可見較多無法維持完整細(xì)胞形態(tài)，見圖1。經(jīng)Bliss法計(jì)算，得出椿乳凝膠對(duì)Hela細(xì)胞的IC50＝47.558 mg·mL^－1，從表1可知椿乳凝膠對(duì)CaSki細(xì)胞的IC50在3～10 mg·mL^－1，TC0＞3 mg·mL^－1；西多福韋對(duì)CaSki和Hela細(xì)胞的IC50分別為182.100和395.196 μg·mL^－1。細(xì)胞存活率≥80%，則認(rèn)為對(duì)細(xì)胞無毒性作用，記為TC0，以H8細(xì)胞TC0、1/2TC0、1/4TC0為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。

因此，椿乳凝膠高、中、低終濃度設(shè)置為5、2.5、1.25 mg·mL^－1，西多福韋終濃度為100、50、25 μg·mL^－1。

圖 1　各組對(duì)人宮頸上皮細(xì)胞H8（A）、人宮頸癌細(xì)胞CaSki（B）和Hela（C）的細(xì)胞毒性作用

表1　各組H8、CaSki、Hela細(xì)胞的增殖

3.2　椿乳凝膠對(duì)人宮頸上皮細(xì)胞周期的影響 

  細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示：在G0/G1細(xì)胞比例明顯減少，S期細(xì)胞比例增加，G2/M期細(xì)胞比例明顯增加，表明其對(duì)宮頸上皮細(xì)胞的修復(fù)作用可能是通過減少間期休眠的細(xì)胞，促進(jìn)其進(jìn)入G2/M期，促進(jìn)細(xì)胞分裂，從而加速受損上皮細(xì)胞的更新。詳見表2。

表2　各組人宮頸上皮細(xì)胞H8的周期(n＝6，x±s)

 3.3　椿乳凝膠對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

椿乳凝膠5 mg·mL^－1處理時(shí)，與溶媒對(duì)照組比較，CaSki及Hela細(xì)胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。西多福韋各濃度組時(shí)CaSki和Hela細(xì)胞凋亡率與溶媒對(duì)照組相比具有明顯差異（P＜0.01），且具有濃度-效應(yīng)關(guān)系。詳見表3和圖3～4。

圖 3　椿乳凝膠對(duì)人宮頸癌細(xì)胞CaSki凋亡的影響

圖 4　椿乳凝膠對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela凋亡的影響

3.4　椿乳凝膠對(duì)HPV16 E6/E7、HPV18 E6/E7蛋白表達(dá)的影響

在給予不同劑量的椿乳凝膠后，從CaSki和Hela細(xì)胞提取的總蛋白中HPV16 E6/E7和HPV18 E6/E7蛋白表達(dá)均下調(diào)，提示椿乳凝膠清除HPV與下調(diào)E6/E7蛋白有關(guān)。結(jié)果詳見圖5～6。

圖 5　椿乳凝膠對(duì)CaSki細(xì)胞攜帶的HPV16 E6/E7表達(dá)的影響

圖 6　椿乳凝膠對(duì)Hela細(xì)胞攜帶的HPV18 E6/E7表達(dá)的影響

3.5　椿乳凝膠對(duì)加德納菌和白假絲酵母菌最小抑菌濃度的影響 

取連續(xù)倍比稀釋的椿乳凝膠藥液或西多福韋與稀釋菌液恒溫培養(yǎng)，鏡下觀察測(cè)定椿乳凝膠或西多福韋對(duì)不同菌株的最小抑菌濃度。結(jié)果顯示，椿乳凝膠有效成分中含有抑菌成分。椿乳凝膠對(duì)加德納菌和白假絲酵母菌均有不同程度的抑菌作用，椿乳凝膠對(duì)加德納菌和白假絲酵母菌的最小抑菌濃度分別為62.5、125 mg·mL－1。西多福韋對(duì)加德納菌和白假絲酵母菌均無明顯抑菌作用。

4、討論

宮頸癌具有潛伏周期長(zhǎng)的特征，是女性常見惡性腫瘤之一。研究表明，大部分感染HPV的患者會(huì)通過自身免疫系統(tǒng)在幾個(gè)月內(nèi)將HPV完全清除，但無法清除如HPV16、HPV18等高危型HPV，使HPV載量維持在高位，由此導(dǎo)致HPV持續(xù)感染，發(fā)展成宮頸炎及宮頸癌。HPV感染宿主細(xì)胞后，引起宮頸上皮細(xì)胞壞死并繼續(xù)感染宿主細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生基因突變，改變細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控，破壞局部機(jī)體免疫系統(tǒng)引起宮頸癌變。

在正常陰道微環(huán)境中，益生菌群及條件致病菌群的豐度、多樣性、密集性呈動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，HPV檢測(cè)也通常為陰性。當(dāng)微環(huán)境中菌群穩(wěn)態(tài)遭到破壞時(shí)，可增加HPV感染的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明假絲酵母菌與HPV感染無明顯相關(guān)性，真菌感染也未增加感染HPV的風(fēng)險(xiǎn)，但陰道加德納菌與HPV感染密切相關(guān)。

椿乳凝膠各中藥組分的現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明：椿皮、苦參、牡丹皮在體外均具有抑菌作用，同時(shí)能夠提高免疫力、升高白細(xì)胞抗炎作用等。乳香可鎮(zhèn)痛，增加多核白細(xì)胞比例，以吞噬壞死的血細(xì)胞，改善新陳代謝，具有消炎作用，可加速炎癥的清除，促進(jìn)傷口的愈合。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，椿乳凝膠對(duì)人宮頸上皮細(xì)胞H8具有修復(fù)作用，可調(diào)節(jié)H8細(xì)胞周期，促進(jìn)受損宮頸上皮細(xì)胞的更新，可促進(jìn)Hela細(xì)胞進(jìn)入凋亡周期，抑制攜帶有HPV18基因的Hela細(xì)胞增殖，對(duì)HPV18 E6/E7蛋白表達(dá)具有顯著的抑制作用。體外抑菌結(jié)果表明椿乳凝膠對(duì)引起陰道菌群失調(diào)的加德納菌和白假絲酵母菌有一定的抑制作用。

綜上所述，椿乳凝膠治療宮頸炎的機(jī)制可能是通過抑制可引起細(xì)胞癌變的HPV18 E6/E7蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)含HPV18基因的細(xì)胞凋亡，殺滅含有HPV18基因的病變細(xì)胞，清除已經(jīng)產(chǎn)生病理性變化的陰道組織，促進(jìn)正常宮頸上皮細(xì)胞的增殖，修復(fù)受損的陰道組織。同時(shí)椿乳凝膠對(duì)引起陰道菌群失調(diào)的加德納菌和白假絲酵母菌具有較好的抑制作用，促進(jìn)陰道菌群平衡的恢復(fù)。椿乳凝膠對(duì)HPV18的抑制作用和對(duì)陰道菌群的調(diào)節(jié)作用，可協(xié)同降低由HPV感染和陰道菌群失調(diào)引起的宮頸炎癥向?qū)m頸癌發(fā)展的可能性。因此椿乳凝膠在治療HPV感染和調(diào)節(jié)陰道菌群平衡方面具有良好療效，值得推薦用于HPV及陰道菌群失調(diào)引起的宮頸炎，同時(shí)可預(yù)防HPV感染引起的陰道炎向?qū)m頸癌發(fā)展。